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诺如病毒G1型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒
参考价:¥2490

型号:

更新时间:2023-11-30  |  阅读:996

详情介绍

产品名称:诺如病毒G1型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒

Name:Norwalk Virus G1(NV-1) RT-PCR Kit

包装规格:50T/盒。

诺如病毒(Norwalk Virus)是单股正链 RNA 病毒,属于人类杯状病毒属,是一种引起非细菌性急性肠胃炎的病毒,如诺病毒感染性强,以肠道传播为主, 通过口-粪传播,以污染的水源、食物、贝类、物品、空气作为主要传播载体。诺如病毒可分为 G I-G 五个基因群,其中引起人类感染的主要是 G1 和 G2 群。因此快速灵敏诊断具有重要意义。本产品以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测诺如病毒 G1 型的试剂盒,它具有下列特点:

1.即开即用,用户只需要提供样品 RNA 模板。

2.引物和探针经过优化,灵敏性高。

3.提供阳性对照,便于区分假阴性样品。

4.特异性高,引物是根据诺如病毒 G1 型高度保守区设计,不会跟其他病毒的RNA 发生交叉反应。

5.本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR 反应。

6.本产品只能用于科研。


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规格及成分

成分十孔盒包装
探针法 qRT-PCR 缓冲液500μL蓝盖
探针法 qRT-PCR 酶混合液100μL(红盖)
荧光PCR 专用模板稀释液1 mL黄盖

诺如病毒 G1 型探针法 qRT-PCR

引物混合液

100 μL白盖
诺如病毒 G1 型 qRT-PCR 探针50 μL棕色管

诺如病毒 G1 型探针法 qRT-PCR

阳性对照(1×10E拷贝/μL)

50 μL黄盖
使用手册

诺如病毒G1型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒运输及保存

低温运输,-20℃保存,保存期限为12个月。

自备试剂样品:RNA

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原, 本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管,分别为 7,6,5,4,3,2。

2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 RT-PCR 专用模板稀释液,最好用带芯枪头,下同)。

3.在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供),充分震荡 1 分钟,得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4.换枪头,在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5.换枪头,在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡 1 分钟,得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 RNA 的制备

7.如果有 N 个样品,最好设置 N+2 个提取,多出的一个是 PC(样品制备阳

性对照),一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL 阳性对照的10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样, 以此作为PC。另外用水作为 NC。

8.用自选方法纯化样品的 RNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。

三、Probe qRT-PCR 反应(20μL 体系,在样品制备室进行)

9.如果做定量分析并且只做 1 次重复,则标记 N+9 个 PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),6 个用于标准曲线。如果做定性分析,并且只做 1 次重复,则标记 N+4 个PCR 管,其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品,1 个用于 PCR 阴性对照(用水做模板),1 个用于 PCR 阳性对照(用第 4 号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10.在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好

后最后加):

成分

样品管

N+2 个

RT-PCR

阴性对照管

标准曲线样品管

(2-7 管)

探针法 qRT-PCR 缓冲液各 10 μL10 μL各 10 μL
探针法 qRT-PCR 酶混合液各 2 μL2 μL各 2 μL
诺如病毒 G1 型 qRT-PCR 探针各 1 μL1 μL各 1 μL

诺如病毒 G1 型探针法 qRT-PCR

引物混合液
各 2 μL2 μL各 2 μL
待测样品 RNA 模板各 5 μL--
超纯水-5 μL-

第 7 步所得标准曲线样品稀释液

(2-7 号)
--

各 5 μL(2号样到 2 号管,3 号样到3 号管…)













11.盖上盖子后上机,按下面参数进行 qRT-PCR:

过程温度时间
逆转录
50℃30min
预变性
94℃10min

qRT-PCR反应

(40个循环)

94℃15sec
60℃1min(采集FAM通道的荧光信号)







四、数据处理

12.如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的 log 值为横轴,以 Ct 值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值,再推算出其浓度。

13.如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品,如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性,如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间,则重复一次。重复实验的 Ct 值如果大于或等于 40 则为阴性,如果小于 35,则为阳性。

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