详情介绍
产品名称:
商品名称:绵羊痘病毒PCR试剂盒
Name:Sheeppox Virus(SPPV) PCR试剂盒
包装规格:50T/盒
预期用途
绵羊痘是由羊痘病毒属中绵羊痘病毒(Sheep pox virus, SPV)引起羊的一种急性、热性、接触性传染病,被世界动物卫生组织(OIE)列为需通报传染病,我国列为一类动物疾病。该病主要表现为体温升高,皮肤、黏膜、内脏器官表面发生广泛性的丘疹、疱疹或结节,淋巴结肿大,病畜消瘦,毛的品质下降,产乳量大幅度降低,严重时导致死亡。羊痘分布广泛,世界各国具有本病爆发和流行的相关报道,中东、非洲北部及中部、亚洲流行尤为严重。
本试剂盒适用于检测绵羊皮肤病变组织、淋巴结、水泡液等样本中的绵羊痘病毒,用于绵羊痘病毒感染的辅助诊断。
检验原理:
绵羊痘病毒PCR试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术,设计一对绵羊痘病毒特异性引物,结合一条特异性探针, 用荧光 PCR 技术对绵羊痘病毒的 DNA 进行体外扩增检测,用于临床上对可疑感染病料的病原学诊断。
试剂组成:
包装规格 | 50T/盒 |
SPV 反应液 | 500μL×2 管 |
酶液 | 50μL×1 管 |
SPV 阳性质控品 | 50μL ×1 管 |
阴性质控品 | 250μL ×1 管 |
说明:不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
储存条件及有效期:
-20℃±5℃,避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次,有效期 12 个月。
适用仪器:
ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
标本采集:
绵羊皮肤病变组织、淋巴结 5g;水泡液取 1mL。
保存和运输:
采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h;若需长期保存,应放置-70℃以下保存,冻融不超过 3 次。
使用方法:
1. 样品处理(样本处理区)
1.1 样本前处理
组织样品:每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手/术/剪剪碎混匀后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心 2min,取上清液 100μL 于1.5mL 灭菌离心管中;咽/拭子样品直接取 100μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
1.2 核酸提取
推荐采用优利科(上海)生命科学有限公司生产的核酸/提取/或纯化试剂(磁珠法或离心柱法)进行核酸提取,请按照试剂说明书进行操作。
2. 试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;样品每满
10 份,多配制 1 份),每测试反应体系配制如下表:
试剂 | SPV 反应液 | 酶液 |
用量 | 19μL | 1μL |
将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中,20μL/管。
3. 加样(样本处理区)
将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀, 短暂离心。
4. PCR 扩增(核酸扩增区)
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
4.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 25μL;
荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择
ROX 参比荧光,选择 None 即可。
4.3 推荐循环参数设置:
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 2min | 否 |
2 | 45 cycles | 95℃ | 15sec | 否 |
60℃ | 30sec | 是 |
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定(请参照各仪器使用说明书进行设置,以分析 ABI7500 仪器为例)
反应结束后自动保存结果,根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值(用户可根据实际情况自行调整,Start 值可设在 3~15、End 值可设在 5~20,使阈值线位于扩增曲线指数期,阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线),点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2 结果判断
阳性:检测通道 Ct 值≤40,且曲线有明显的指数增长曲线; 阴性:样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3 质控标准
阴性质控品:无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示;
阳性质控品:扩增曲线有明显指数增长期,且 Ct 值≤32; 以上条件应同时满足,否则实验视为无效。
6.检测方法的局限性
1. 样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关;
2. 样本提取过程中没有控制好交叉污染,会出现假阳性结果;
3. 阳性对照、扩增产物泄漏,会导致假阳性结果;
4. 病原体在流行过程中基因突变、重组,会导致假阴性结果;
5. 不同的提取方法存在提取效率差异,会导致假阴性结果;
6. 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降,出现假阴性或定量检测不准确的结果;
7. 本检测结果仅供参考,如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1. 所有操作严格按照说明书进行;
2. 试剂盒内各种组分使用前应自然融化,wan全混匀并短暂离心;
3. 反应液应避光保存;
4. 反应中尽量避免气泡存在,管盖需盖紧;
5. 使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服;
6. 样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行,以免交叉污染;
7. 实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器;
8. 试剂盒里所有物品应视为污染物对待,并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
【参考文献】
[1] 康文玉, 徐自忠, 高洪等. 羊痘病毒[J]. 中国畜牧兽医, 2004, 31(12):33-36.
[2] 陈轶霞. 羊痘诊断技术研究进展[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(34):15008-15009.
[3] 国家质量监督检验检疫总局. SN/T 2452-2010 绵羊痘和山羊痘检疫技术规范[S].
[4] 李杨, 于少雄, 颜新敏, 等. 绵羊痘病毒 TaqMan-MGB 荧光定量 PCR 快速检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报, 2016.