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更新时间：2024-07-18 | 阅读：336
详情介绍
猪链球菌实时荧光PCR试剂盒
产品名称：猪链球菌实时荧光PCR试剂盒
英文名称：Streptococcus sui SYBR qPCR Kit
猪链球菌（Streptococcus sui）是具有荚膜的一种革兰氏阳性球菌。可根据其细胞壁抗原成分将其大致归类为兰氏分群群链球菌。根据其荚膜抗原（CPS） 的不同，猪链球菌被分为 35（1~34 型,1/2 型）种血清型,其中 1，2，7，9 型是猪的致病菌。猪链球菌的定植部位为猪的上呼吸道，尤其是扁桃体和鼻腔。部分血清型的猪链球菌具有致病性，主要通过伤口感染。可引起猪的急性败血症脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎等疾病。部分菌株可引起人类感染，造成细菌性脑炎或引起中毒样休克综合征。因此快速检测猪链球菌具有重要意义。荧光定量PCR 是检测传染性疾病的主流技术，本产品就是以染料法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测猪链球菌通用的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供 DNA 模板。
2.特异性高，引物是根据猪链球菌通用高度保守区设计,不会扩增其他细菌。
3.引物和扩增体系经过优化，灵敏性比常规 PCR 高 100 倍。
4.提供无传染性的 PCR 阳性对照，便于区分假阴性样品。
5.一管式操作，荧光 PCR 检测，不容易产生环境污染。
6.本产品只能用于科研，本试剂盒足够 50 次 20μL 体系的 PCR。
【试剂组成】
成分 | 包装 |
2×qPCR MagicMix | 500ul（棕色管） |
荧光 PCR 专用模板稀释液 | 1ml（黄盖） |
猪链球菌通用 qPCR 引 物混合液 | 100ul（白盖） |
猪链球菌通用 qPCR 阳性对照 (1×10E8 拷贝/μL) | 50ul（黄盖） |
核酸释放剂 | 1ml（绿盖） |
使用手册 | 1份 |
【运输及保存】
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
【自备试剂】样品 RNA。
【注意事项】
一、制备标准曲线样品（以 10E2-10E7 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能
污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原， 本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1.标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
2.用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）
3.在 7 号管中加入 5 μL 阳性对照（其浓度为 1×10E8 拷贝/μL，试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E7 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 DNA 的制备
7.用自选方法纯化样品的 DNA，本产品跟市场上绝大多数核酸纯化产品兼容。
8.如果有 N 个样品，则需要进行 N+2 个样品提取，多出的一个用作样品制备阳性对照管、另一个用作样品制备阴性对照管。本试剂盒免费赠送1ml免DNA提取的核酸释放剂，该释放剂的裂解液可以直接作为PCR 模板，省略了 DNA 提取步骤。其使用手册可向客服索取。
三、设置 qPCR 反应（20μL 体系，在样品制备室进行）
9.如果进行定量分析，则标记 N+9 个 PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的N+2 个样品，1 个用于 PCR 阴性对照，6 个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则 6 个标准曲线样品只选一个做（可以选 4 号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。
10.在标记管中按下表加入各成分：
成分 | N+2 个 样品管 | PCR 阴性 对照管 | 标准曲线 样品管（2-7 管） |
2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
猪链球菌通用 qPCR 引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
自备 10×ROX (见注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
N+2 个待测样品 DNA 模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
自备超纯水 | 不加 | 6 μL | 不加 |
第 7 步所得标准曲线样品稀释液 （2-7 号） |
不加 |
不加 | 各 6μL（2 号样到 2 号管，3 号样到 3 号管…） |
注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480） 不需要使用 ROX，则用水替代。
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。
四、荧光定量 PCR 反应参数
过程 | 温度 | 时间 |
预变性 | 95℃ | 10min |
PCR 反应 （40 个循环） | 95℃ | 15 sec |
60℃ | 1 min（采集 SYBR 通道的荧光信号） | |
按仪器预设程序进行熔解曲线分析 | ||
五、数据处理
12.设定 60℃-96℃范围的熔解曲线分析，排除假阳性。
13.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
14.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于或等于 35 则为阳性。如果在 35-40 之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。
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