一.染色过强 原因 解决方法 

1.抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜 

2.孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度 c DAB显色时间过长或浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准。

二.非特异性背景染色 原因 解决方法 

1.操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟 

2.组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长 

3.组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭

4.血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间。

三.染色弱 原因 解决方法 

1.抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60分钟 

2.试剂超过有效使用时间 应更换试剂 

3.操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液 使试剂稀释 （应防止切片干燥） 4.室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜 e 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟。

四.染色阴性 原因 解决方法 

1.操作步骤错误 应重试 设阳性对照 

2.组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果

3.一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误